Materiales y equipos
- Frascos de vidrio con tapón 100ml
- Embudo de decantación 100ml
- Viales de vidrio de 20ml
- Viales de HPLC 2ml
- Cloroformo
- HCL 30%
- Acetonitrilo
- Agua destilada
- MgSO4
Toma de muestras y almacenamiento
Distinguimos entre muestras acuosas que proceden de experimentos realizados en laboratorio, de muestras ambientales. Las muestras procedentes de experimentos realizados en laboratorio no requieren ningún tipo de tratamiento especial de almacenamiento previo al análisis si se realiza en el momento. Si pasara tiempo hasta su análisis, al igual que las muestras ambientales deberán ser almacenadas en refrigeración hasta su posterior análisis.
Extracción de las muestras
El método de extracción de PPCPs se basa en el descrito por Rodriguez-Rodriguez et al. (2010) y Bautista et al. (2009). Para extraer NAP y CBZ de muestras acuosas se trabajará con cloroformo como solución extractante ya que el uso de otros reactivos descritos en la bibliografía como diclorometano, acetonitrilo o n-hexano presentó problemas emulsificación.
Debido a la volatilidad y toxicidad de dicho solvente, será necesario trabajar en campana extractora y se recomienda el uso de una mascarilla apropiada para este tipo de reactivos.
- Las muestras pueden ser de diferentes volúmenes pero se trabajará con una proporción muestra:coloformo de 2:1. Para proceder con la extracción se toman 30ml de muestra acuosa y se lavan con 15 ml en total de cloroformo. Poner la muestra acuosa en un frasco de vidrio con tapón para evitar la volatilización del cloroformo y añadir 5ml del mismo.
- Introducir la mezcla en un embudo de decantación de 100ml y mezclar manualmente mediante movimientos suaves del embudo para evitar que se forme emulsión. Dejar que la fase acuosa (medio acuoso) y la fase orgánica (cloroformo + NAP y CBZ extraídos) se separen.
Recoger en un vial de vidrio de 20ml la fase orgánica. Repetir esta operación 3 veces lavando la fase acuosa hasta completar los 15ml totales de cloroformo. Dejar evaporar el cloroformo en el interior de la campana extractora.
Si este proceso no fuera completamente eficaz, se puede agitar la mezcla en un agitador orbital durante 15-20 min. a 150rpm antes de la separación y decantación.
En caso de que cierta cantidad de fase acuosa se hubiera recogido en el vial, se puede retirar mediante la adición de una pequeña cantidad de MgSO4 sin hidratar que actuará como agente secante. - Una vez evaporado por completo el cloroformo, resuspender el precipitado (NAP y CBZ extraídos) en 2ml de acetonitrilo (calidad HPLC) y dejar en el vial durante 5 min. agitando manualmente cada poco tiempo para permitir la completa disolución de los PPCPs. posteriormente, recoger los 2ml de muestra y traspasar a un vial de HPLC, filtrando la muestra previamente con ayuda de una jeringa de 1ml y un filtro de 0,22μm. Precintar el vial y reservar en refrigeración hasta su posterior análisis en UHPLC.
Cromatografía
El presente protocolo se basa en el descrito por Stafiej et al. (2007), optimizado para un UHPLC de Shimadzu y para naproxeno y carbamacepina.
Condiciones:
Fase A- acetonitrilo
Fase B- agua destilada ácida pH 4.0 (acidificación con ácido clorhídrico)
| Time (min.) | Programad de gradiente fase móvil | (%) | (%) |
|---|---|---|---|
| Isocrático |
Volumen de inyección: 10 μl
Flujo 0,5 ml/min
Tª: 25ºC
Tipo de columna: Luna C18 (2). 7.5 cm longitud x 4,6 mm diámetro interno. Tamaño de partícula 3μl.
REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS
Stafiej A., Pyrzynska K., Regan F., (2007) Determination of anti-inflammatory drugs and estrogens in water by HPLC with UV detection. Journal of Sep. Science. Vol 30, p. 985–991.
Bautista L.F., Sanz R., Molina M.C., González N., Sánchez D. (2009). Effect of different non-ionic surfactants on the biodegradation of PAH by diverse aerobic bacteria. Int. Biodeterioration & Biodegradation. Vol 30, p. 1–10.
Rodriguez-Rodriguez C., Marco Urrea E., Caminal G. (20109) Degradation of naproxen and carbamazepine in spiked sludge by slurry and solid-phase Trametes versicolor systems. Bioresource Technology. Vol 101; p. 2259–2266