Materiales y equipos
- Mortero de porcelana
- Cajas de poliespan con hielo picado para mantener las muestras frías.
- Acetona grado HPLC.
- Tubos Eppendorf de 2 ml
- Viales de HPLC y tapones con septum
- Filtros de jeringa de 0.22 micras
- Jeringas
Toma de muestras y almacenamiento
Se recogen las hojas (100 mg de peso fresco*) o algas (50 mg) y se congelan rápidamente con nitrógeno líquido. El material debe etiquetarse y transportarse en neveras hasta el laboratorio donde se guardará en el congelador de -80ºC hasta su extracción. Es importante no romper la cadena de frío y mantener siempre las muestras en oscuridad.
* Pesar en el laboratorio 100 mg de hojas previamente para saber qué cantidad de muestra coger en campo.
Extracción de las muestras
Este paso debe de ser muy rápido ya que vamos a trabajar sin nitrógeno líquido. Se trabajará siempre en hielo y sin luz (se entiende sin luz artificial, podemos trabajar con luz natural. Para transportar las muestras taparlas con papel de aluminio)
- Se pesan 100 mg de hojas (o 50 mg de alga) y se introducen en el mortero.
- Se añade 1 ml de acetona (calidad HPLC), se homogeneiza y se vierte el extracto en un tubo eppendorf de 2ml. A continuación se lava el mortero con otro ml de acetona y se añade al tubo.
- Se centrifugarán los tubos a 5000rpm durante 5 min. Se extraerá el sobrenadante con una jeringuilla, a la que se le acoplará un filtro de 0.22 micras.
- Se introducirá la muestra filtrada en un vial de 2ml de HPLC (siempre se trabajará en hielo y oscuridad).
- Etiquetar la muestra y guardar el congelador hasta su análisis, aunque siempre será mejor inyectar la muestra inmediatamente en el HPLC tras su extracción.
Método de análisis
En el presente protocolo se utiliza el método descrito por García Plazaola y Becerril (2001), optimizado para el UHPLC Nexera de Shimadzu.
Condiciones:
Fase A- acetonitrilo: metanol: tampón Tris (0,1 M, pH 8) (84:2:14)
Fase B- metanol: acetato de etilo (68:32)
| Time (min) | A Conc. (%) | B Conc. (%) |
|---|---|---|
| 0 | 100> | 0 |
| 7 | 0 | 100 |
| 11 | 0 | 100 |
| 11.50 | 100 | 0 |
| 15 | 100> | 0 |
Volumen de inyección: 10µl
Flujo; 1ml/min
Tª: 25ºC
Tipo de columna: Poroshell HPH-C18. 46x10mm, 2.7mm
Gradiente:
